生物膜（biofilm）也称为生物被膜，是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。由于生物膜在环境中随处可见，对抗生素抗性很强，因此，生物膜形成机理及调控吸引了很多研究人员的注意。我们使用土壤细菌，荧光假单胞菌作为模式生物，研究如何控制这种细菌生物膜的形成。

Shiro Yoshioka 说：“Phenom ProX 和 ParticleMetric 软件结合使用，有效地统计出生物膜中的杆形细菌的尺寸信息”

转座子突变通常用于标识所需的生物膜形成的基因。将转座子插入到参与生物膜的形成的基因中，该突变体可以显示基于这种基因，生物膜形成增加或减少情况。通过这种技术，我们找到了负责合成细菌第二信使的一种基因。

相对于与野生型菌株，c-di-GMP 的损失引起了生物膜形成的减少。在本次研究中，我们也发现，破坏 de novo 嘌呤核苷酸生物合成的一个基因也可以引起生物膜形成的减少。因为这种基因对于生物合成途径上的重要性在多种细菌上被报导，我们研究了这些突变体，弄清了这种生物合成途径与荧光假单胞菌生物膜形成之间的关系。

Phenom ProX 对于生物膜研究的应用

虽然突变体形成的生物膜减至不到 WT 的一半，细胞计数实验表明，生物膜中的突变细胞数目与 WT 相当。要解释这一结果，我们推测突变体在生物膜中的细胞尺寸变得比 WT 更小。换句话说，突变引起生物膜细胞细胞尺寸减少。这种假设也有依据，因为突变体不能合成 AMP 和 GMP，可能导致突变体的增长放缓。

扫描电子显微镜 (SEM) 是检查细菌生物膜中细胞大小的*方法之一。为了获取有关生物膜中细菌细胞的尺寸信息，我们使用一个桌面扫描电镜，Phenom ProX，使得我们可以样品制备后的一分钟内获得扫描电镜图像。这快的速度使得我们可以针对每个突变采集多张显微照片以便通过 ParticleMetric 软件进一步详细分析。图 1 为 Phenom ProX 拍摄的荧光假单胞菌清晰的图片。

图 1

生长在聚氯乙烯表面荧光假单胞菌生物膜细胞的扫描电镜图像 (放大倍率︰ 12，000 x)

飞纳电镜 Phenom ParticleMetric 软件的强大力量

扫描电镜图像比较明确显示出突变体的尺寸发生了减小。然而，它很难定量描述 WT 和突变体细胞大小的区别。Phenom ProX 的 ParticleMetric  软件能够快速识别扫描电镜图像中的每个细胞的各种参数。因为荧光假单胞菌是杆形的，外接的圆直径可以很好的近似为细胞的长度。使用此软件，我们从几个扫描电镜图像中收集超过 1,500 的单个细胞的外接的圆直径，创建直方图，并计算相关的外接的圆直径 (图 2) 中位数。

Phenom ParticleMetric  软件自动执行此过程。我们*的关注点的是自动颗粒检测有时将聚集细胞视为单个细胞。ParticleMetric 允许直观地从数据中移除这种细胞。计算的结果显示，该突变细胞的长度相对于 WT 比缩减了 25 ~ 30%。因此，Phenom ProX 和 ParticleMetric 软件的证据，成功地证明了我们做出的“突变的细胞在生物膜中相对于 WT 变得更小”的假设。

图 2
ParticleMetric 软件生成的统计了超过 1,500 个荧光假单胞菌生物膜细胞的外接圆直径的直方图，外接的圆直径的中位数计算结果是 1.79µm，除了直方图，也可以显示任何一个选定细胞的参数

结论

Phenom ProX 桌面扫描电镜和 ParticleMetric 软件有效地统计了生物膜内细菌细胞的大小数据，对生物膜研究中的应用提供有价值的信息。因为许多细菌由于养分有效性或抗生素而改变它们的大小和形态，在细胞的大小和形态的识别与统计将是未来的研究在生物膜研究的必要条件。Phenom ProX 和简单易用快速的 ParticleMetric 软件将为微生物的研究人员提供很大的帮助。